PCR是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過(guò)程，以擬擴(kuò)增的模板DNA分子，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)重復(fù)地變性一退火一延伸三步，擴(kuò)增新的目的DNA鏈，這個(gè)過(guò)程通過(guò)控制反應(yīng)體系的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)。那么你知道PCR反應(yīng)體系包括什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
 

　　一、模板(template)
 

　　模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等)，但必須符合兩個(gè)條件：一是純度必須較高，二是濃度不能太高以免抑制。模板是待擴(kuò)增的目的基因或特異片段，如診斷病人是否攜帶有突變基因時(shí)，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。
 

　　二、引物(primers)
 

　　人工合成的一對(duì)引物可以分別與兩條模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序列，其中一條稱為上游引物，另一條稱為下游引物。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L，濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般為15~30bp,引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3'末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G(因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸)。引物GC占45%~55%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。
 

　　三、底物(dNTP)
 

　　dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)至7.0~7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。一般存儲(chǔ)濃度為10mo/L，各成分以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20~200umol/L，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。
 

　　四、PCR緩沖液(PCR buffer)
 

　　緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四種有效成分：①緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；②一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；③二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；④輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu)。
 

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